Więźniem Auschwitz rotmistrz Pilecki został dobrowolnie w 1940 roku, dając się aresztować Niemcom w łapance. Wykonał w ten sposób rozkaz infiltracji - zorganizowania w obozie struktur ruchu oporu i prowadzenia działalności wywiadowczej. Miał numer 4859. Zbierał informacje między innymi o zagładzie Żydów. Utworzył też konspiracyjny Związek Organizacji Wojskowych (początkowo Tajna Organizacja Wojskowa), który z czasem rozrósł się do wielu komórek ulokowanych w kilku komandach. Nie była to jedyna taka grupa działająca w obozie. Celem Pileckiego było połączenie wszystkich organizacji konspiracyjnych i przygotowanie powstania.

W kwietniu 1943 roku, po niemal trzech latach, obawiając się dekonspiracji i aby zmobilizować dowództwo w Warszawie do działania, zdecydował się na ucieczkę, Dzięki kontaktom konspiracyjnym umożliwił dwóm pozostałym uciekinierom dostanie się do komanda zatrudnionego na nocnej zmianie w piekarni w Oświęcimiu, poza terenem obozu. Podczas pracy byli oni pilnowani jedynie przez dwóch esesmanów. W nocy z 26 na 27 kwietnia 1943 roku, wykorzystując nieuwagę Niemców, opuścili teren piekarni, kierując się na wschód.

Rok później Witold Pilecki brał udział w Powstaniu Warszawskim. W latach 1944-1945 przebywał w niemieckiej niewoli. Po uwolnieniu dołączył do 2. Korpusu generała Władysława Andersa.? W październiku 1945 roku, na rozkaz generała, wrócił do Polski, by prowadzić działalność wywiadowczą na rzecz 2. Korpusu. Zorganizował siatkę wywiadowczą i rozpoczął zbieranie informacji wywiadowczych o sytuacji w Polsce - o żołnierzach Armii Krajowej i 2. Korpusu więzionych w obozach NKWD i deportowanych do Związku Sowieckiego. Prowadził też wywiad w Ministerstwie Bezpieczeństwa Publicznego, MON i MSZ. Nie wykonał rozkazu generała Andersa, polecającego mu opuszczenie Polski w związku z groźbą aresztowania.

Został zatrzymany przez bezpiekę w 1947 roku i w pokazowym procesie oskarżony przez komunistyczne władze o działalność szpiegowską. Torturowany blisko rok w areszcie, podczas ostatniego widzeniu z żoną powiedział, że "Oświęcim to była igraszka". Został skazany na śmierć i stracony strzałem w tył głowy w więzieniu na warszawskim Mokotowie 25 maja 1948 roku. Pozostawił córkę i syna.

Rodziny nie poinformowano o wykonaniu wyroku, a paczkę, dostarczoną do więzienia przez żonę, oddano z informacją, że "wyjechał". Bliscy poznali prawdę dużo później. Jego ciała do dziś nie odnaleziono. Po przeprowadzonych w 2012 roku ekshumacjach ustalono, że pochowano go w zbiorowej mogile w Kwaterze na Łączce na warszawskich Powązkach. Prace poszukiwawcze trwają.

Wyrok skazujący Witolda Pileckiego został unieważniony w 1990 roku przez Sąd Najwyższy. W 2006 roku rotmistrz został pośmiertnie odznaczony Orderem Orła Białego. W 2013 - awansowany do stopnia pułkownika.
Brytyjski historyk profesor Michael Foot zaliczył Witolda Pileckiego do sześciu najodważniejszych ludzi ruchu oporu podczas II wojny światowej.

W 2018 roku imię Witolda Pileckiego otrzymała reprezentacyjna Sala Obrazowa w Kancelarii Prezesa Rady Ministrów. Pamiątkową tablicę odsłoniła córka rotmistrza Zofia Pilecka-Optułowicz.